O ensaio conta com controles negativos e positivos, que são testados em triplicata. As leituras dos controles são utilizadas para a validação e o cálculo do cutoff. Para validação, sempre se deve observar os critérios abaixo:

• O coeficiente de variação das leituras entre os micropoços dos controles negativos e positivos não deve ultrapassar 25%.

• A divisão da média das leituras de RLU dos controles positivos pelos negativos deve ser superior a 2,0

• Os controles negativos devem respeitar o limite máximo de background de 250 RLU.

Há ainda dois outros controles intra-teste. O primeiro é quando se faz a adição do reagente de desnaturação. Todas as amostras devem tornar-se de cor roxa, isso dá a certeza de que todo material será desnaturado. O segundo, quando da adição das sondas, a coloração deve mudar de roxo para amarelo, assegurando que todas as amostras receberam a quantidade ideal de sonda.